Archive for the ‘Teknologi Budidaya’ Category

PGC sebagai Cikal Bakal Sel Gamet

25 Maret 2009

pgc1PGC adalah prekursor embrionik dari gamet. PGC muncul dari jaringan ekstra-gonadal dan melakukan migrasi melalui jaringan somatis menuju calon gonad, dimana PGC mengalami poliferasi dan diferensiasi menjadi sel-sel oogonia atau spermatogonia. Adanya ketidaknormalan pada proses perkembangan ini dapat menyebabkan kekurangan embrionik germ cells yang berakibat pada ketidaksuburan (infertilitas) pada individu dewasa. PGC merupakan sel-sel pembentuk gamet yang mampu memindahkan fenotip dari setiap individu termasuk semua cacatnya ke generasi berikutnya.

Pada awal perkembangan gonad tidak ada PGC yang terdapat pada gonad vertebrata. PGC kelinci dapat diidentifikasi sesaat dan selama awal tahap gastrulasi, di sekitar bagian proksimal dari epiblast, di dalam daerah ekstra gonadal dan ekstra embrionik, dekat dengan daerah kantung kuning telur di dasar allantois. Pada akhirnya PGC akan bermigrasi ke gonad untuk membentuk germ line di ovarium atau testis. Alkalin fosfatase digunakan sebagai penanda untuk PGC karena bisa menunjukkan reaksi positif pada tikus di jaringan embrio yang berbeda. Dengan menggunakan kriteria ukuran sel dan struktur elektron, titik awal PGC berada dapat dikenali. PGC pada teleostei dapat dikenali pada sekitar tahap somitogenesis. Beberapa peneliti sepakat bahwa pada tempat pertama kali PGC dikenali merupakan tempat asal pembentukan PGC. Meskipun demikian, tidak dapat diabaikan bahwa populasi kecil PGC telah ada pada sebelum tahap gastrulasi akhir dan bermigrasi menuju posisi dimana PGC dapat diidentifikasi baik secara morfologi maupun dengan eksprerimen tranplantasi embriologi.

Spesifikasi PGC pada zebrafish tergantung pada pewarisan plasma germinal dimana beberapa molekul RNA seperti nanos dan vasa berada. Vasa merupakan RNA helikase yang pada mulanya diidentifikasi pada Drosopila, merupakan homolog dan tampak seperti RNA atau protein pada garis keturunan germ cell dari semua organisme yang dipelajari hingga saat ini. Pada Zebrafish, transkrip vasa telah dapat dideteksi dengan hibridisasi in-situ di oosit serta dengan hibridisasi Northern dan sejumlah besar hibridisasi in-situ pada telur-telur yang baru saja mengalami fertilisasi.

Dengan analisis histokimia, keberadaan PGC dapat dikenali sehingga memudahkan dalam proses isolasi PGC. Pada organisme yang bereproduksi secara seksual, garis keturunan germ cell muncul dari PGC pada awal tahap embriogenesis. Kemajuan dalam bidang biologi sel dan biologi molekuler telah memungkinkan mengidentifikasi sel dengan menggunakan penanda molekuler. Pelabelan dengan menggunakan lebih dari satu warna dapat secara simultan ditampilkan secara in vivo termasuk ekspresi gen, pertukaran ion-ion, perubahan protein dan organel sel, kromosom serta proses lainnya.

Spesifikasi PGC pada ikan telah dipelajari dengan lebih jelas pada teleostei dengan observasi menggunakan mikroskop cahaya dan elektron. PGC telah dikenali dengan ukurannya yang besar dan mempunyai struktur seperti nuage dengan ciri khas padat elektron. Jika dibandingkan dengan sel-sel somatis, PGC berukuran lebih besar (10-20 µm) dengan ukuran inti yang besar juga (6-10 µm. Salah satu karakteristik dari PGC adalah adanya nuage. Kehadiran nuage dapat diketahui dengan analisis ultrastruktur PGC. Nuage merupakan agregasi dari RNA dan protein yang nampak seperti terpisah, inklusi sitoplasmik padat elektron dan sering diamati berasosiasi dengan mitokondria. PGC dapat diidentifikasi secara kimiawi dengan alkalin phosphatase seperti yang dilakukan pada tikus dan baru-baru ini dengan menggunakan RNA binding factor yaitu vasa pada lalat dan zebrafish. Marker molekuler pertama untuk PGC pada ikan adalah Vasa mRNA zebrafish yang diekspresikan dalam PGC dari beberapa spesies. Vasa pada awalnya diidentifikasi pada Drosophila sebagai gen maternal untuk formasi segmen-segmen abdominal dan untuk spesifikasi germ cell. Sama seperti beberapa organisme lain, vasa mRNA zebrafish disuplai secara maternal dan dideteksi di dalam PGC pada semua tahap perkembangan germ line.

PGC dapat digunakan sebagai sarana untuk mengintroduksi gen-gen asing, karena sel ini dapat menjadi dewasa mengikuti perkembangan generasi melalui gametogenesis dan fertilisasi. PGC akan berubah menjadi gamet yang bertanggungjawab terhadap perkembangan organisme baru pada generasi berikutnya.

Priadi Setyawan, S.Pi M.Si

Prosedur Analisis Histologis Jaringan Ikan

25 Maret 2009

mikrotom1Analisis histologis merupakan teknik pengamatan sel serta jaringan tubuh ikan yang sering digunakan. Analisis ini bertujuan untuk menghasilkan sediaan histologis yang dapat diwarnai dengan pewarna khusus sehingga dapat diamati secara langsung dengan menggunakan mikroskop cahaya. Tahapan analisis histologis pada ikan meliputi :

1. Pengambilan jaringan ikan. Pada sampel ikan yang masih kecil dapat langsung fiksasi tanpa dipotong. Pada ikan yang berukuran besar diambil jaringan tertentu yang akan diamati dan dimasukkan ke dalam larutan fiksasi.

2. Fiksasi. Larva atau ikan berukukan kecil difiksasi dengan larutan PFA 4% dalam medium Phosphate buffered saline (PBS). Sampel dimasukkan ke dalam botol yang sudah berisi larutan fiksatif dengan perbandingan antara sampel dengan larutan adalah 1:20. kemudian disimpan selama 24 jam dalam refrigerator. Setelah 24 jam kemudian sampel diambil dan dicuci dengan PBS selama 5 menit sebanyak 3 kali untuk menghilangkan sisa-sisa PFA sebelum ke tahap selanjutnya. Ikan yang berukuran relatif besar difiksasi dengan larutan Bouin’s selama 1 minggu dalam suhu kamar. Selanjutnya sampel dicuci dalam larutan alkohol 70% hingga warna kuning hilang, kemudian sampel disimpan dalam alkohol 70% hingga pemrosesan lebih lanjut. Sampel yang berukuran besar harus melaui prosedur dekalsifikasi dalam larutan 5 % trichloroacetid acid selama 24 jam untuk melunakkan struktur tulangnya.

3. Dehidrasi. Sampel yang sudah difiksasi kemudian dimasukkan berturut-turut ke dalam larutan sebagai berikut: Alkohol 70%, Alkohol 80%, Alkohol 90%, Alkohol Absolut I, Alkohol Absolut II, masing-masing selama 45 menit, kemudian dilanjutkan ke proses penjernihan.

4. Penjernihan (clearing). Sampel dari proses dehidrasi dimasukkan ke dalam larutan alkohol:xylol 1:1 dan 1:3 selama 30 menit. kemudian Xylol I dan Xylol II masing-masing selama 30 menit.

5. Infiltrasi. Sampel yang sudah dijernihkan dalam xylol diinfiltrasi secara bertahap dalam campuran xylol : paraffin 3:1 ; 1:1 dan 1:3 masing-masing selama 30 menit, dilanjutkan dengan paraffin murni sebanyak 2 x 60 menit. Seluruh rangkaian infiltrasi dilakukan dalam inkubator pada temperatur 58-60 0C.

6. Penanaman sampel (Embedding). Parafin dicairkan di dalam inkubator pada temperatur 60 0C. Cetakan berukuran 2 x 2 x 2 cm diisi dengan paraffin cair, bagian bawah cetakan didinginkan di atas blok es sehingga paraffin pada dasar cetakan agak memadat. Sampel diletakkan di atas paraffin yang agak memadat tersebut sesuai dengan orientasi irisan yang direncanakan, kemudian ditempelkan holder yang telah diberi label sesuai dengan kode sampel. Cetakan paraffin selanjutnya dibiarkan dalam temperatur ruang agar parafinnya memadat.

7. Pengirisan (Sectioning) dan peletakan pada gelas obyek. Water bath disiapkan dengan suhu 40-50 0C dan disiapkan wadah berisi air dingin. Kemudian blok yang sudah didinginkan dipasang di mikrotom yang sudah diatur pada ketebalan 4-7 μm. Putaran mikrotom dibuat konstan sampai blok yang berisi sampel jaringan teriris. Setelah itu irisan dipindahkan ke dalam baskom yang berisi air dingin, kemudian ditempelkan pada gelas obyek yang sudah dilapisi gelatin dan diberi kode sama dengan blok yang di iris. Selanjutnya dicelupkan ke dalam air hangat dalam water bath agar irisan mengembang. Kemudian ditiriskan untuk dilakukan pewarnaan.

Priadi Setyawan, S.Pi M.Si